Caldo de Moeller
Caldo de Moeller para determinar Descarboxilación de Aminoácidos.
FUNDAMENTO
La base para descarboxilasa de Moeller se emplea para la diferenciación bioquímica de los bacilos entericos y microorganismos a fines, mediante pruebas que involucran la descarboxilación de los aminoácidos. Los aminoacidos más empleados son: Lisina, Ornitina y Arginina las cuales se agregan para obtener una concentración final de 1 o 2% en el medio base. Los aminoacidos se esterilizan por filtración, ya que la esterilización por calor desnaturaliza las proteinas.
A diferencia de la base de carbohidratos, la de Moeller lleva glucosa con el propósito de discriminar entre las reacciones positivas de las negativas. Una reacción de descarboxilación de aminoacidos alcaliniza el medio (contrario a los carbohidratos) por lo que el púrpura de bromocresol no variará significativamente de color. Si la bacteria no descarboxila el aminoacido contenido en el caldo, fermentará la glucosa produciendo ácidos que harán virar el púrpura de bromocresol al amarillo. De esta manera, el color púrpura indica descarboxilación y amarillo ausencia de descorboxilación.
La prueba de descarboxilación requiere de una atmósfera libre de oxígeno, por lo que el medio ya inoculado debe sellarse con aceite mineral estéril.
El medio tiene incorporado un indicador de pH combinado (púrpura de bromocresol y rojo cresol).
COMPOSICIÓN
Nutrientes: Peptonas, extracto de levadura, piridoxal.
Sustrato: Aminoácido según requerimiento. Dextrosa (glucosa) para discriminar los positivos de los negativos.
Indicador de pH: Púrpura de bromocresol y rojo cresol.
Temperatura de Incubación: 35-37oC.
Tiempo de Incubación: 18-24 horas.
SUSTRATO ENZIMA PRODUCTO TERMINAL
Lisina » lisina decarboxilasa » Cadaverina
Ornitina » ornitina descarboxilasa » Putrecina
Arginina » arginina dehidrolasa » Citrulina
NOTA:
El producto terminal de la arginina (citrulina) es convertido en ornitina, luego se da la descarboxilación y como producto final resulta la putrecina.
Las descarboxilasas son un grupo de enzimas que actúan sobre sustratos específicos, capaces de reaccionar con el residuo carboxilo (COOH) de los aminoácidos para formar aminas alcalinas. Cada enzima descarboxilasa es específica para cada aminoácido.
PREPARACIÓN
Preparar el medio de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
• Para determinar la actividad descarboxilasa de un determinado aminoácido, se agrega al caldo base en concentración del 1%. (L(+) lisina, o L(+) ornitina, o L(+) arginina).
• Generalmente no es necesario ajustar el pH cuando se emplea L arginina o L lisina, pero con a L ornitina hay que hacer el ajuste antes de la esterilización. El pH final debe ser de 6.8 ± ?? 0.2
• Conservar refrigerado (4 – 10° C).
TÉCNICA DE INOCULACIÓN
Rotular el tubo que contiene el caldo.
Con un asa recta, tomar un inóculo del agar nutritivo o TSA.
Inclinar el tubo e inocularlo, tocando la superficie interna del tubo, en el ángulo agudo del menisco formado por el caldo.
Volver el tubo a la posición vertical, lo cual tiene el efecto de sumergir el punto de inoculación bajo la superficie.
Agregue de 5 a 10 gotas de aceite mineral estéril.
Incubar el tubo.
Leer la reacción bioquímica del medio.
Fuente: Manual de Procedimientos Bacteriológicos en Infecciones Intrahospitalarias. MINSA-INS. 2005. Manual de Procedimientos de Bacteriología Médica del CNDR/MINSA edición 2004
Triple Azúcares y Hierro (TSI)
Agar Hierro Tres Azúcares o Triple Azúcares y Hierro (TSI)
FUNDAMENTO
Este medio se utiliza para determinar la capacidad de los bacilos gramnegativos para fermentar lactosa, sacarosa y glucosa, así como para determinar su capacidad de producir H2S (ácido sulfhídrico).
Fermentación de los Carbohidratos:
El medio contiene dos cámaras de reacción, en la parte inclinada se fermenta la sacarosa y la lactosa y en la parte profunda se fermenta la glucosa. Se puede fermentar los 3 carbohidratos o uno de ellos depende de la bacteria que se estudie.
Producción de Sulfuro de Hidrógeno:
Si la bacteria tiene la enzima tiosulfatasa, reacciona con el tiosulfato de Na como una fuente de azufre para la producción del sulfuro de hidrógeno, el cual es incoloro, pero al reaccionar con sales de hierro, en este caso citrato férrico, se produce un precipitado de color negro. Para que esto ocurra debe haber un pH ácido, lo cual se consigue con la fermentación de la glucosa.
Producción de Gas:
El primer paso es la fermentación de la glucosa, uno de cuyos productos terminales es el ácido fórmico.
Si la bacteria tiene la enzima deshidrogenasa fórmica, el ácido fórmico es descompuesto en CO2 y H2.
COMPOSICIÓN
Nutrientes: Peptona
Sustratos: Glucosa, Lactosa, Sacarosa, Sulfato Ferroso, Tiosulfato de Sodio
Indicador de pH: Rojo fenol
Temperatura de Incubación: 35-37oC
Tiempo de Incubación: 18-24 horas
NOTA: En caso de sospechar de Salmonella Typhi hay que dejar incubar hasta 48 horas.
SUSTRATO ENZIMA PRODUCTO TERMINAL
Fermentación de Carbohidratos:
Lactosa ═ Galactósido permeasa Acido pirúvico
(glucosa+galactosa) Galactosidasa Acidos mixtos
Glucosa ═ Glucosa Acido pirúvico
6 fosfato deshidrogenasa Acidos mixtos
Sacarosa ═ Invertasa Acido pirúvico
Acidos Mixtos
Producción de gas:
Ac. Fórmico ═ Deshidrogenasa fórmica CO2 + H2
Producción de H2S:
Tiosulfato ═ Tiosulfatasa H2S
de sodio (incoloro)
║
Precipitado color negro ═ Sales de hierro
Citrato de Na
TÉCNICA DE INOCULACIÓN
Rotular el tubo que contiene el medio de cultivo.
Seleccionar una UFC y tomar un inóculo con un asa recta. El inóculo debe ser tomado de la superficie de la UFC. No tome la muestra por arrastre ya que puede llevar partes de otras UFCs.
Introducir el asa en forma vertical hasta unos 2-3 mm antes de llegar al fondo. Tener cuidado de no tocar el fondo del vidrio del tubo porque puede entrar aire atmosférico y se anulan las condiciones de anaerobiosis.
Estriar la parte inclinada del agar desde el fondo a la parte superior con un movimiento en forma de S a medida que se retira el asa del tubo.
Incubar el tubo.
Leer la reacción bioquímica del medio.
Fuente: Manual de Procedimientos de Bacteriología Médica del CNDR/MINSA edición 2004
Agar Lisina Hierro (LIA)
FUNDAMENTO
Es un medio para detectar enzimas que descarboxilan o desaminan la lisina en bacilos gramnegativos.
Adicionalmente detecta enzimas que producen sulfuro de hidrógeno y gas proveniente de la glucosa.
Prueba de descarboxilación de la Lisina:
Si la bacteria posee la enzima descarboxilasa, la descarboxilación de la lisina produce cadaverina, un producto terminal alcalino que acentúa el color violeta del medio. Un requerimiento previo de la descarboxilación es un pH ácido, el cual se logra con la fermentación de la glucosa. Esta reacción se lleva a cabo en anaerobiosis, por lo que se observa en la parte profunda del medio.
Prueba de desaminación de la Lisina:
La desaminasa de la lisina actúa solo en ambiente de aerobiosis por lo que se verá en la parte inclinada.
La desaminación de la lisina termina en productos cetoácidos que en combinación con el Fe+++, (proveniente del citrato de amonio férrico) hacen que la molécula combinada se observe de color rojo intenso. El indicador de pH no interviene en este caso. Por esta razón, la lectura de esta reacción no se abrevia con los símbolos de ácido (A) sino como R (rojo).
No existen enterobacterias que posean las dos enzimas (descarboxilasa y desaminasa de la lisina) por lo que sólo se tiene que observar, o una de ambas reacciones o la ausencia de ambas. Cuando no hay desaminasa ni descarboxilasa, en la parte inclinada se observará una alcalinización del medio por crecimiento y muerte bacteriana, la cual hará que esta parte se observe de color violeta (K) y en la parte profunda, acidificación por los productos terminales de la fermentación de la glucosa. En este caso, la parte profunda se observará de color amarillo (A).
Producción de Sulfuro de Hidrógeno:
La presencia de la enzima tiosulfatasa actuará sobre el tiosulfato de sodio y se producirá H2S, que en presencia del hierro proveniente del citrato de amonio férrico, formarán un precipitado de color negro.
Producción de Gas:
La presencia de la enzima deshidrogenasa fórmica actuará sobre el ácido fórmico proveniente de la fermentación de la glucosa y en consecuencia, habrá gas de CO2 y H2.
COMPOSICIÓN
Nutriente: Peptona
Sustratos: Lisina, glucosa, citrato de amonio férrico, tiosulfato de sodio
Indicador de pH: Rojo fenol
Temperatura de Incubación: 35-37oC
Tiempo de incubación: 18-24 horas
SUSTRATO ENZIMA PRODUCTO TERMINAL
Descarboxilación o desaminación de la lisina:
Lisina » Lisina Decarboxilasa » Cadaverina
Lisina » Lisina Desaminasa » Ácido acetocarbónico
Fermentación de carbohidratos:
Glucosa » Glucosa 6 fosfato » Ácido pirúvico
Deshidrogenasa Ácidos mixtos
Producción de gas:
Ácido Fórmico » Deshidrogenasa fórmica » CO2
Producción de H2S
Tiosulfato de sodio » Tiosulfatasa » H2S
(incoloro)
Precipitado ║
de color negro «═ Sales de hierro
PREPARACIÓN
Preparar de acuerdo con las indicaciones del fabricante.
• Autoclavar a 121 °C, 15 libras / pulg2 por 15 minutos.
• Distribuir aproximadamente 5 mL en tubos de 13 x 100. Dejar enfriar en posición inclinada, para producir una columna de aproximadamente 3 cm de altura y sobre ella, una superficie inclinada de por lo menos la misma longitud.
TÉCNICA DE INOCULACIÓN
Rotular el tubo que contiene el medio de cultivo.
El medio debe ser inoculado con la misma UFC que se sembró en TSI.
Introducir el asa ven forma vertical hasta unos 2-3mm antes de llegar al fondo. Tener cuidado de no tocar el fondo del vidrio del tubo porque puede entrar aire atmosférico y se anulan las condiciones de anaerobiosis. Repetir dos veces mas este procedimiento, de tal manera que las tres punciones se hagan en los vértices de un triángulo imaginario.
Estriar la parte inclinada del agar desde el fondo a la parte superior con un movimiento en forma de S a medida que se retira el asa del tubo.
Incubar el tubo.
Leer la reacción bioquímica del medio.
Fuente: Manual de Procedimientos Bacteriológicos en Infecciones Intrahospitalarias. MINSA-INS. 2005. Manual de Procedimientos de Bacteriología Médica del CNDR/MINSA edición 2004
Agar Citrato Simmons
FUNDAMENTO
Determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el citrato como única fuente de carbono.
COMPOSICIÓN
Sustrato: Citrato de Na, fosfato de amonio monobásico.
Amortiguadores: Fosfato de potasio dibásico, cloruro de sodio, sulfato de magnesio.
Indicador de pH: Azul de bromotimol
Temperatura de incubación: 35-37°C
Tiempo de Incubación: 24 – 48 horas. Máximo 4 días
SUSTRATO ENZIMA PRODUCTO TERMINAL
Citrato » Citratasa » Hidróxido de Na y Carbonato de sodio
PROCEDIMIENTO
Preparar de acuerdo con las indicaciones del fabricante.
• Calentar suavemente hasta su disolución.
• Colocar aproximadamente 4 a 5 mL en cada tubo.
• Autoclavar a 121 °C, 15 libras / pulg2 por 15 minutos.
• Dejar que el medio solidifique en posición inclinada, con poca profundidad en pico de flauta.
• Refrigerar para su conservación (4 – 10 °C).
TÉCNICA INOCULACIÓN
Rotular el tubo que contienen el medio de cultivo.
Con un asa recta, tomar un inóculo del agar nutritivo o TSA.
Estriar la superficie del agar desde el fondo a la parte superior con un movimiento de ida y vuelta en forma de S a medida que se retira el asa del tubo.
Incubar el tubo.
Leer la reacción bioquímica del medio.
Fuente: Manual de Procedimientos Bacteriológicos en Infecciones Intrahospitalarias. MINSA-INS. 2005, Manual de Procedimientos de Bacteriología Médica del CNDR/MINSA edición 2004
Medio de SIM
FUNDAMENTO
Medio de cultivo de ensayo, para comprobar la formación de sulfuro, la producción de indol y la motilidad, en el marco del diagnóstico de enterobacteriáceas.
COMPOSICIÓN g/lt
Peptona de caseina 20.0g
Peptona de carne 6.6g
Sodio tiosulfato 0.2g
Amonio y hierro (III) citrato 0.2g
Agar-agar 3.0g
PREPARACIÓN
Disolver 30 g/lt, distribuir en tubos hasta unos 4 cm de altura y esterilizar al autoclave. Ph 7.3 +- 0.1
PROCEDIMIENTO
El cultivo puro sometido a exámen se siembra por picadura en la columna del medio de cultivo. Incubación 18-24 horas a 37°C.
INTERPRETACIÓN
La motilidad se pone de manifiesto por la turbidez difusa del medio de cultivo alrededor del canal de la picadura.La no motilidad se caracteriza por crecimiento producido exclusivamente a lo largo de dicho canal. La producción de H2S se reconoce por el ennegrecimiento de la zona de crecimiento. Para la demostración del indol se recubre ulteriormente los tubos con reactivo de indol según KOVACS. La formación de indol dá lugar a una coloración rojo-purpúrea de la capa de reactivo.
Fuente: Medios de Cultivo en Microbiología Manual de Laboratorio. UNMSM. M. Mendo Rubio.