Medios Nutritivos Simples
CALDO NUTRITIVO
COMPOSICIÓN
- Extracto de carne 0,3 g
- Peptona 1,0 g
- Dextrosa 0,5 g
- Cloruro de sodio 0,5 g
- Agua destilada 100 ml
- pH 7,0 - 7,4
PREPARACIÓN
1. Disolver en agua destilada los ingredientes previamente pesados.
2. Someter a la acción del calor, agitando constantemente hasta llegar al primer hervor.
3. Ajustar el pH con las tiras indicadoras de pH. Si está por debajo de un pH de 6,8
(acida) agregar gota a gota la solución de NaOH, si por el contrario está por encima de 7,4 (alcalino) agregar gota a gota la solución de HCL hasta el pH adecuado (7,0 - 7,4).
4. Envasar el medio en tubos y esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 minutos.
5. Controlar la esterilidad colocando el medio envasado en una incubadora a 37°C por 24 horas.
6. Mantener el medio envasado en la refrigeradora hasta el momento de usarlo.
AGAR NUTRITIVO
COMPOSICIÓN
- Extracto de carne 3 g
- Peptona 5 g
- Agar 15 g
- Agua destilada 1 000 ml
- pH final 6.8 +/- 0,2 a 25°C
PREPARACIÓN
1. Disolver los ingredientes previamente pesados en 1 000 ml de agua destilada, cuidando de disolver primero el agar.
2. Someter a la acción del calor y calentar hasta el primer hervor para que se disuelva por completo, agitando constantemente.
3. Ajustar el pH con las tiras indicadoras de pH. Si está por debajo de un pH de 6,8 (ácida) agregar gota a gota la solución de NaOH, si por el contrario está por encima de 7,0 (alcalino) agregar gota a gota la solución de HCL hasta el pH adecuado (6,8 - 7,0).
4. Envasar el medio en tubos o placas de Petri y llevarlos a esterilizar al autoclave.
5. Controlar la esterilidad y mantener el medio envasado en la refrigeradora hasta el momento de usarlo.
6. El medio debe ser de color ambar claro, de transparente a ligeramente opalescente.
Fuente: Procedimientos de Laboratorio. Ministerio de Salud. INS. Perú.
Medios Nutritivos Enriquecidos
AGAR SANGRE
1. En un frasco licuar 100 ml de agar nutritivo estéril, en baño maría a 55° C.
2. Dejar enfriar hasta alcanzar una temperatura de 45°C, es decir, hasta que calor sea soportable en el dorso de la mano.
3. Agregar 5 ml de sangre citrada o desfibrinada de carnero con una pipeta estéril.
Agitar por rotación en forma suave, con el fin de obtener una buena mezcla y evitar la formación de burbujas.
4. Su color normal debe ser rojo cereza homogéneo.
5. Repartir el contenido en placas Petri estériles y dejar solidificar.
6. Controlar la esterilidad en incubadora a 37 ° C, por 24 horas.
7. Mantener el medio envasado en la refrigeradora.
AGAR CHOCOLATE
1. Preparar agar sangre hasta obtener su color normal rojo cereza.
2. Llevar el agar sangre antes de su solidificación al baño maría a 80°C por 10 minutos. Por el calentamiento, el color rojo cereza cambiara al chocolate, debido a la ruptura de los hematies y la salida de la hemoglobina.
3. Durante el calentamiento mezclar constantemente para evitar la formación de precipitado (grumos).
4. Repartir con mucho cuidado en las placas Petri para evitar la formación de burbujas.
5. Otra manera de preparar agar chocolate es utilizar como base un agar de Mueller Hinton mezclado con sangre de carnero.
Fuente: Procedimientos de Laboratorio. Ministerio de Salud. INS. Perú.
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Medios Selectivos o Especiales
AGAR MAC CONKEY
COMPOSICIÓN
- Peptona 17,0 g
- Proteosa peptona 3,0 g
- Lactosa 10,0 g
- Sales biliares 1,5 g
- Cloruro de sodio 5,0 g
- Agar 13,5 g
- Rojo neutro 0,03 g
- Cristal violeta 0,001 g - pH 7,1
PREPARACIÓN
1. Para rehidratar el medio se suspenden 50 gramos de agar Mac Conkey en 1 000 ml de agua destilada fría.
2. Calentar hasta el punto de hervor para disolver el medio completamente.
3. Esterilizar en el autoclave durante 15 minutos a 121 °C.
4. Cuando el medio se ha enfriado a 50°C, repartir en placas Petri más o menos 20 a 25 ml por placa.
AGAR SALMONELLA SHIGELLA (SS)
COMPOSICIÓN
- Extracto de carne 5,0 g
- Proteosa peptona 5,0 g
- Lactosa 10,0 g
- Sales biliares 8,5 g
- Citrato de sodio 8,5 g
- Tiosulfato sódico 8,5 g
- Citrato férrico 1,5 g
- Agar 13,5 g
- Verde brillante 0,00033 g
- Rojo neutro 0,025 g - pH 7,0 +/- 0,1
PREPARACIÓN
1. Para rehidratar el medio preparado se suspende 60 gramos de agar salmonella shiguella en 1 000 ml de agua destilada fría.
2. Calentar hasta punto de hervor para disolverlo por completo.
3. Repartir el medio en placas Petri, más o menos 20 a 25 ml por placa.
No se debe esterilizar en autoclave.
AGAR TRIPLE AZUCAR HIERRO (TSI)
COMPOSICIÓN
- Extracto de carne 3,0 g
- Extracto de levadura 3,0 g
- Peptona 15,0 g
- Proteosa peptona 5,0 g
- Lactosa 10,0 g
- Sacarosa 10,0 g
- Glucosa 1,0 g
- Sulfato ferroso 0,2 g
- Tiosulfato do sodio 0,3 g
- Agar 15,0 g
- Rojo do fenol 0,024g
- Cloruro de sodio 5,0 g
PREPARACIÓN
1. Pesar 65 gramos de agar triple azúcar hierro (TSI) para 1 000 ml de agua destilada.
2. Calentar al fuego hasta mezclar completamente.
3. Esterilizar a 121 °C, durante 15 minutos.
4. Repartir en tubos, de tal manera que queden con 2,5 cm de fondo y 3,5 cm de tendido (medio inclinado).
THAYER-MARTIN MODIFICADO
COMPOSICIÓN
- Agar 10 g
- Medio base: para gonococos (GC) 36 g
- Hemoglobina 10 g
- Suplemento nutritivo 10 ml
- Solución de antibióticos 10 ml
- Agua destilada 1 000 ml - pH final 7,2 +/- 0,2 a 25°C
PREPARACIÓN
1. En un matraz de 250 ml colocar 125 "perlas de vidrio" (que sirven para obtener una buena mezcla) agregar los 10 gramos de hemoglobina y 125 ml de agua destilada, agitar hasta observar completa disolución.
2. En una probeta de 500 ml colocar un embudo de vidrio con filtro de gasa-algodón - gasa (a manera de sandwich) para filtrar la solución de hemoglobina. Completar a 500 ml con agua destilada y al final, colocar esta solución en un matraz de 2 litros para ser esterilizada en el autoclave.
3. En un matraz de 2 litros mezclar 36 gramos de medio de GC base y 10 gramos de agar en 500 ml de agua destilada, calentando hasta hervir para disolver completamente.
4. Esterilizar por separado el agar base GC y la solución de hemoglobina en autoclave a 121 °C por 15 minutos.
5. Mantener estas soluciones estériles en baño maría a la temperatura de 50 - 56°C.
6. Rehidratar el suplemento nutritivo con líquido rehidratante estéril y agitar para asegurar una completa disolución. Seguir las instrucciones del fabricante.
7. Rehidratar la solución de antibióticos con agua destilada estéril y dejar reposar 20 minutos. Seguir las instrucciones del fabricante.
8. Agregar al medio base 10 ml de suplemento nutritivo y 10 ml de solución de antibióticos, mezclando suavemente.
9. Mezclar suavemente la solución de hemoglobina al agar base y mantener en baño maría a la temperatura de 50 - 56°C hasta el momento de repartir el medio.
10. Repartir en placas estériles 15 a 20 ml por placa 100 mm de diamétro.
*Los medios que no van ser utilizados deben conservarse a temperatura de refrigeración (aproximadamente durante 6 semanas) protegidos con bolsas de plástico, con la finalidad de reducir al mínimo la deshidratación.
*Los medios almacenados a ambiente se conservan entre 2 - 3 semanas.
Fuente: Procedimientos de Laboratorio. Ministerio de Salud. INS. Perú.
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Preparación de los principales medios de cultivo
• Se debe asegurar el máximo porcentaje de sustancias nutritivas de crecimiento.
• Debe adaptarse la reacción final del medio de cultivo, a un pH óptimo para los microorganismos que se van a cultivar, con errores no mayores de 0.1 de la unidad del pH requerido.
• No debe olvidarse que una filtración exagerada del medio puede eliminar las sustancias nutritivas.
• La esterilización debe tener un control minucioso de la temperatura y tiempo de duración. La prolongación indebida en el tiempo de esterilización destruye las sustancias nutritivas y se produce una reducción del volumen de los medios.
• Debe usarse durante la preparación de los medios solo recipientes de cristal de preferencia Pyrex o similares.
• La repartición de los medios de cultivo se realiza siempre cerca del mechero de Bunsen (o de alcohol), en tubos o placas Petri. En los tubos se debe formar un plano inclinado y en las placas se debe tener una distribución homogénea.
• Los medios de cultivo contenidos en tubos se conservan mejor en refrigeración, ya que se disminuye la evaporación.
• Se tiene medios inclinados en tubo y medios en placa Petri:
- Medios inclinados en tubo, se emplea principalmente para resembrar cepas aisladas previamente, con la finalidad de identiticarlas.
- Medios en placa Petri, se emplea principalmente para permitir el crecimiento de colonias individualmente aisladas. Las placas se colocan en la estufa con la base hacia arriba.
• Debe seguirse al pie de la letra las instrucciones escritas en relación con la preparación de medios de cultivo, debiendo usarse exclusivamente, productos quimicamente puros, a no ser que se indique lo contrario.
• En casas comerciales los medios se adquieren en forma deshidratada. Se debe registrar en el recipiente del medio deshidratado la fecha de recepción y de apertura. Entre uso y uso, se debe almacenar como se indica en la etiqueta, con escasa luz, baja humedad ambiental, y con el recipiente fuertemente tapado.
• Antes de empezar a usar un nuevo lote de medios de cultivo, realizar un control de calidad del medio.
Fuente: Procedimientos de Laboratorio. Ministerio de Salud. INS. Perú.